CD133功能化肝素/膠原蛋白多層膜改性小口徑膨脹體聚四氟乙烯人造血管

聚四氟乙烯 張 鵬 華東理工大學材料科學與工程學院

  小口徑膨脹體聚四氟乙烯(ePTFE)人造血管是血管移植手術中最常見的替代品之一,然而術后血栓的形成和血管內腔的再狹窄是導致手術失敗的重要因素。采用靜電層層自組裝的方法構建CD133功能化肝素/膠原蛋白(HEP/COL)多層膜可以抑制血栓的形成,并且為血管的內皮化提供可能;通過掃描電鏡、紅外譜圖跟蹤HEP/COL多層膜的組裝過程,利用激光共聚焦顯微鏡來證明抗體的接枝。結果發現,CD133功能化的HEP/COL多層膜成功地覆蓋到了ePTFE人造血管表面;接觸角從127°減小到106°,表明血管的浸潤性得到提高;血小板吸附的實驗結果表明,改性后的人造血管表面血小板吸附數量明顯減少,具有良好的抗凝血性。

  動脈粥樣硬化具有發病率高、死亡率高的特點,是當今醫學的一大難題。冠脈搭橋、心外動脈靜脈搭橋手術是常見的治療手段。然而,人體自身血管由于來源少、取材困難,遠無法滿足需求。膨脹體聚四氟乙烯(ePTFE)人造血管化學性質穩定、質地柔軟、具有良好的抗壓性,是良好的血管植入材料。與所有植入材料一樣,遠期血栓的形成也是ePTFE人造血管的一大缺點。尤其當血管口徑小于5mm時,由于血流量低,遠期血栓發生率接近100%。盡管在表面接枝肝素等生物分子可以提高人造血管的抗凝血性和血液相容性,但這些作用往往不能持久。通過人造血管內壁的內皮化,獲得與人體自身血管結構、生理環境相似的材料仍然是防止術后形成遠期血栓最理想的途徑。

  本文通過層層自組裝(Layer-by-layer assembly)的方法將肝素(HEP)、膠原(COL)吸附到ePTFE人造血管表面,并通過戊二醛固定CD133抗體。ePTFE材料表面張力很小,通過聚乙烯亞胺(PEI)分子處理可以有效地提高其表面張力,在血管表面形成穩定的聚陽離子。HEP是一種陰離子多糖,它可以和抗凝血酶III結合成復合物,提高抗凝血酶III對凝血因子的抑制作用,因此作為抗凝劑已經廣泛應用于臨床中。COL作為細胞外基質的組成成分,大量存在于動物結締組織中,可以有效地提高血管的細胞相容性。利用層層自組裝將HEP/COL分子交替沉積到血管表面。CD133是一種高度保守的抗原,只表達在未分化的內皮祖細胞上,通過接枝CD133抗體,利用抗體與內皮祖細胞表面抗原的特異性結合實現對血液中內皮祖細胞的捕獲。因此,改性后的血管表面形成PEI-(HEP/COL)5-CD133涂層,在獲得抗凝血性的同時,能夠快速內皮化,防止遠期血栓的形成及術后血管的再狹窄。

1、實驗部分

  1.1、原料

  ePTFE人造血管,口徑4mm,美國Gore-tex公司;聚乙烯亞胺(PEI),Mw=10000,溶解于pH為7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中,質量濃度為3mg/mL;HEP,上海伯奧生物科技有限公司;COL,上海源葉生物科技有限公司;HEP和COL溶解于pH 為4的醋酸/醋酸鈉緩沖液,濃度都為1mg/mL;戊二醛(GA),上海凌峰化學試劑有限公司;CD133抗體,德國美天旎公司,用PBS溶液稀釋至60μg/mL。

  1.2、HEP/COL多層膜制備和CD133抗體接枝

  1.2.1、構建HEP/COL多層膜 ePTFE人造血管

  浸泡在乙醇溶液中0.5h,清洗后的血管置于60℃的烘箱中干燥1h。然后將血管放入PEI的PBS緩沖溶液中,靜置1.5h后,得到表面帶正電荷的血管。將血管放入HEP溶液中,15min后取出,用醋酸緩沖液沖洗表面結合不牢的HEP分子,并用N2吹掃干燥。干燥后的血管立即放入COL溶液中,同樣浸泡15min后,用醋酸緩沖液清洗,N2干燥。再重復上述過程4次,得到表面有5層HEP/COL膜的血管,用PBS溶液清洗,N2吹干。

  1.2.2、CD133抗體的接枝

  完成上述改性后,將血管浸入質量分數為0.25%的戊二醛溶液中2h,對HEP/COL進行交聯反應,同時得到大量未反應的醛基,取出血管,用PBS溶液清洗3次,用N2吹干。然后將血管置于60μg/mL的CD133溶液中一夜,通過CD133與活性醛基反應,獲得(HEP/COL)5-CD133多層膜。帶有紅色熒光的CD133-PE抗體的接枝反應同上。

  1.3、儀器與測試

  掃描電鏡:用日本日立S-4800場發射掃描電子顯微鏡觀察樣品表面形貌,樣品經過噴金處理20s,放大倍數為1 000倍,掃描電壓為10kV;紅外光譜檢測:用美國Nicolet 5700測定紅外光譜,采用衰減全反射,測試范圍為400~4 000cm-1;激光共聚焦測試:利用德國Carl Zeiss公司的LSM 510META(Axiovert 200)共聚焦激光掃描顯微鏡觀察血管表面熒光標記的抗體,激光波長670nm;接觸角測試:采用SZ10-JC2000A(上海中晨數字技術設備有限公司)靜滴接觸角測量儀來測定水和試樣的接觸角:在血管表面選擇5個不同的點,測出數值后,求出平均值(在室溫下測試,液滴體積2μL)。

  1.4、血小板黏附實驗

  將血管片浸泡于新鮮的血小板血漿(取自上海市血液中心)中,作用30min后,用PBS溶液清洗血管片,然后用質量分數為1%的戊二醛固定30min,并用乙醇溶液梯度脫水,靜置干燥后用掃描電鏡觀察表面血小板的吸附情況。

2、結果與討論

  2.1、掃描電鏡觀察形貌

  圖1為HEP/COL聚電解質生物涂層改性前后ePTFE人造血管的SEM 照片(放大倍數均為1000倍)。從圖1(a)可見,未經處理的ePTFE血管由很多節點和纖維組成,呈現出三維的孔隙結構,孔隙長度約為15μm,寬度約為5μm。圖1(b~e)分別為(HEP/COL)1、(HEP/COL)2、(HEP/COL)3、(HEP/COL)4、(HEP/COL)5涂層修飾后ePTFE血管的電鏡圖。由圖可見,隨著涂層數n 的增加,HEP/COL涂層的面積不斷變大,ePTFE血管的三維孔隙結構仍然存在,但孔徑尺寸減小。這種表面形貌的逐步改變證明了HEP/COL電解質膜已經成功地組裝在人造血管上。

肝素/膠原多層膜改性前后血管表面的SEM 圖片

圖1 肝素/膠原多層膜改性前后血管表面的SEM 圖片

結論

  本文通過層層自組裝的方法成功地將HEP、COL分子層層吸附到ePTFE人造血管表面,利用戊二醛接枝CD133抗體,使得CD133抗體均勻地分布在人造血管表面,得到了CD133 功能化的HEP/COL多層膜。改性后的人造血管親水性增強,血小板吸附實驗的結果表明血管表面幾乎沒有血小板聚集,提高了人造血管的抗凝功能,并且在血管內皮化方面有很好的應用前景。